MSC (중간엽 줄기세포) 배양 시 세포의 본래 특성인 모양, 다분화능, 표면 마커들을 유지하는 것은 매우 중요합니다. 

특히 MSC가 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력을 유지하는지 확인하기 위한 골 형성 분화 실험은 필수적입니다. 

 

■ 골 형성 분화 방법

 

Step 0: 준비물

 • 중간엽 줄기세포 (MSC) 

 • 골형성 분화 배지 

 • 세포 배양 플레이트 

 • 4% formaldehyde 

 • Alizarin Red S 

 

 Step 1: 세포 시딩 (Seeding) 

 • MSC를 5×10³ cells/cm²로 culture plate 에 시딩하세요.

 • 플레이트 선택: 

     o 염색 분석: 12-well plate 

     o 유전자 발현 분석: T-75 flask 

     o 면역세포화학 연구: 96-well plate

 

Step 2: 배지 교체

 • Confluency 70-80%에 도달하면 골 형성 분화 배지로 교체합니다.

 • 배지 교체는 3-4일 주기로 진행하세요. 

 

Step 3: 분화 확인

 • 분화 7-14일 후: Alkaline Phosphatase 염색을 통해 초기 골 형성을 확인합니다. 

 • 분화 21일 후: Alizarin Red S 염색을 통해 확실한 골 형성을 확인할 수 있습니다. 

 • 유전자 발현 분석으로도 분화를 확인하여 더욱 정확하게 평가할 수 있습니다. 

 

 

■ Alizarin Red S 염색법 (골 형성 확인)

 

lizarin Red S 염색은 MSC의 골 형성 분화를 확인하는 주요 방법 중 하나입니다. 실험 단계는 다음과 같습니다:

  1. 배양: 분화 배지로 21일 이상 배양한 후, 배지를 제거하고 DPBS로 세포를 헹굽니다. 

  2. 세포 고정: 4% formaldehyde로 30분간 세포를 고정하세요. 

  3. 염색: 고정된 세포를 증류수로 두 번 헹군 후, 2% Alizarin Red S 용액(pH 4.2)으로 2-3분간 염색합니다. 

  4. 세척 후 관찰: 염색 후 증류수로 세 번 헹군 후, 광학 현미경을 통해 정성적 또는 정량적으로 골 형성 분화를 평가하세요. 

                                                                               

 

■ 실험 팁

• 세심한 관리: 배지 교체와 염색 과정에서 세포 손상을 방지하는 것이 매우 중요합니다.

• 성공적인 분화 확인: 이 실험을 통해 MSC의 골세포로의 분화 여부를 정확하게 평가할 수 있습니다.