세포 생존율은 세포 실험의 결과를 평가하는 데 있어 중요한 지표입니다. Hoechst와 Propidium Iodide (PI)를 병용한 Live/Dead 염색법은 살아있는 세포와 죽은 세포를 직관적으로 구분할 수 있는 유용한 방법으로, 형광현미경 또는 Flow Cytometry를 사용하여 결과를 분석합니다.

[세포 생존율 측정]

Step 0: 준비물

•       Hoechst 33342 염색 시약

•       Propidium Iodide (PI) 염색 시약

•       세포

•       PBS (Phosphate Buffered Saline)

•       형광현미경 또는 Flow Cytometry

Step 1: 세포 준비

• 형광현미경 분석 시,세포가 plate에 배양중인 상태 그대로 준비합니다.

• Flow Cytometry 분석 시,배양된 세포를 plate에서 분리하여 단일세포 현탁액을 준비합니다.

Step 2: 염색 시약 준비

1.     Hoechst 33342를 제조사의 권장 농도(예: 5-10 μg/mL)로 희석합니다.

2.     PI를 PBS에 제조사의 권장 농도(예: 1 μg/mL)로 희석합니다.

3.     시약은 빛에 민감하므로 암조건에서 준비합니다.

Step 3: 세포 염색 

• 형광현미경 분석 시

1.      세포의 상층액을 제거하고 DPBS로 1회 세척해준다.

2.      희석한 Hoechst와 PI 염색 시약을 세포가 있는 plate에 추가합니다. 보통 Hoechst와 PI를 동시에 첨가하며, 100 μL/well (96-well 플레이트 기준) 또는 세포를 완전히 덮을 만큼 추가합니다.

3.      15-30분간 실온 또는 37℃에서 암조건 하에 반응시킵니다.

• Flow Cytometry분석 시

1.      세포 배양 후, 세포를 트립신이나 적절한 효소로 처리하여 Flow Cytometry분석에 필요한 단일 세포 현탁액을 준비합니다.

2.      효소 처리가 끝난 후, 세포를 배양액으로 중화한 뒤 300-500g에서 5분간 원심분리합니다.

3.      상층액을 제거하고 PBS로 세포를 2회 세척하여 잔여 효소와 배양액을 제거합니다.

4.      세포를 PBS에 재현탁하여 농도를 1×10⁶ cells/mL로 조절합니다.

5.      Hoechst와 PI 염색 시약을 최종 농도가 맞도록 첨가하고, 암조건에서 15-30분간 반응시킨 뒤 Flow Cytometry로 분석합니다.

Step 4: 결과 분석

전체 세포: Hoechst가 세포 핵을 염색하여 파란 형광 발현

죽은 세포: PI가 손상된 세포막을 통해 핵산과 결합하여 빨간 형광 발현

•       형광현미경 분석: 세포 이미지를 촬영하여 형광을 발현하는 세포들의 수를 측정하고 비율을 계산

ex) ’Hoechst_cell counts: 200, PI_cell counts: 10’ 일 때 생존율은 [1-(10/200)] x 100 = 95%

•       Flow Cytometry 분석:각 형광 신호에 따라 세포의 비율(%)을 계산하여 생존율 도출

[주의사항 및 팁]

• Hoechst는 살아있는 세포와 죽은 세포 모두에서 염색되므로, PI와 병용해야 정확한 생존율 분석이 가능합니다.
• 시약을 준비할 때 제조사의 프로토콜을 정확히 따릅니다.
• 염색 후 세포를 너무 오래 방치하면 형광 신호가 감소할 수 있으므로 신속히 관찰합니다.
• 플레이트 형식에 따라 적절한 시약 부피와 세척 횟수를 조정합니다.
• 결과의 신뢰성을 높이기 위해 대조군(염색하지 않은 세포)을 포함합니다.

성공적인 실험을 기원합니다!