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세포 생존율은 세포 실험의 결과를 평가하는 데 있어 중요한 지표입니다. Hoechst와 Propidium Iodide (PI)를 병용한 Live/Dead 염색법은 살아있는 세포와 죽은 세포를 직관적으로 구분할 수 있는 유용한 방법으로, 형광현미경 또는 Flow Cytometry를 사용하여 결과를 분석합니다.
Step 0: 준비물
• Hoechst 33342 염색 시약
• Propidium Iodide (PI) 염색 시약
• 세포
• PBS (Phosphate Buffered Saline)
• 형광현미경 또는 Flow Cytometry
Step 1: 세포 준비
Step 2: 염색 시약 준비
1. Hoechst 33342를 제조사의 권장 농도(예: 5-10 μg/mL)로 희석합니다.
2. PI를 PBS에 제조사의 권장 농도(예: 1 μg/mL)로 희석합니다.
3. 시약은 빛에 민감하므로 암조건에서 준비합니다.
Step 3: 세포 염색
1. 세포의 상층액을 제거하고 DPBS로 1회 세척해준다.
2. 희석한 Hoechst와 PI 염색 시약을 세포가 있는 plate에 추가합니다. 보통 Hoechst와 PI를 동시에 첨가하며, 100 μL/well (96-well 플레이트 기준) 또는 세포를 완전히 덮을 만큼 추가합니다.
3. 15-30분간 실온 또는 37℃에서 암조건 하에 반응시킵니다.
1. 세포 배양 후, 세포를 트립신이나 적절한 효소로 처리하여 Flow Cytometry분석에 필요한 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
2. 효소 처리가 끝난 후, 세포를 배양액으로 중화한 뒤 300-500g에서 5분간 원심분리합니다.
3. 상층액을 제거하고 PBS로 세포를 2회 세척하여 잔여 효소와 배양액을 제거합니다.
4. 세포를 PBS에 재현탁하여 농도를 1×10⁶ cells/mL로 조절합니다.
5. Hoechst와 PI 염색 시약을 최종 농도가 맞도록 첨가하고, 암조건에서 15-30분간 반응시킨 뒤 Flow Cytometry로 분석합니다.
Step 4: 결과 분석
전체 세포: Hoechst가 세포 핵을 염색하여 파란 형광 발현 죽은 세포: PI가 손상된 세포막을 통해 핵산과 결합하여 빨간 형광 발현
• 형광현미경 분석: 세포 이미지를 촬영하여 형광을 발현하는 세포들의 수를 측정하고 비율을 계산 ex) ’Hoechst_cell counts: 200, PI_cell counts: 10’ 일 때 생존율은 [1-(10/200)] x 100 = 95%
• Flow Cytometry 분석:각 형광 신호에 따라 세포의 비율(%)을 계산하여 생존율 도출
성공적인 실험을 기원합니다!
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