오늘은 세포 배양 실험의 제일 기본이지만 초심자에게는 다소 어려울 수 있는 세포를 계산해서 계대하는 방법에 대해 설명해 보겠습니다. 전체적인 흐름을 눈으로 보는 것이 이해하기 더 쉽기 때문에 아래의 링크에서 영상을 먼저 보고 오시는걸 추천 드립니다.

 

 

 

                                                                                                                         

 

 

 

 

 

 

[세포 계대 방법]

1. 세포 계대 (Sub-culture)는 cell plate나 cell dish에 세포가 70~80% 정도 찼을 때 진행합니다.
2. 실험하기 20~30분 전에 DPBS와 배지를 37℃ water bath에 넣고 따뜻하게 데워줍니다.
3. Cell plate나 cell dish 내의 배양배지를 suction한 다음 DPBS로 세포를 세척해 줍니다 (2회 반복, 90 mm dish 기준 DPBS는 1회당 약 5 ml 사용)
4. DPBS로 suction이 끝나면 Trypsin-EDTA (Cell dissociation solution)를 넣어 잘 퍼트려주고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3~5분간 incubation 해줍니다. (90 mm dish 기준 Trypsin은 약 1 ml 사용)
5. Incubation이 끝나면 현미경을 통해 cell이 바닥에서 떨어졌는지 확인합니다.
6. 약 4 ml의 배양 배지를 cell plate나 cell dish에 넣은 다음 피펫팅을 통해 세포들이 뭉치지 않도록 잘 풀어서 15 ml conical tube에 옮겨 담습니다. (Trypsin 1 ml 기준 배양 배지 4 ml 첨가)
7. 원심분리기를 사용하여 cell을 침전시킵니다. (세포 종류 및 연구실에 따라 원심분리 조건은 다르나, 주로 일반세포는 2000~3000rpm로 3~5분 정도 원심분리)
8. 원심분리가 끝나면 cell pellet이 딸려오지 않도록 조심히 상층액을 suction한 다음 배양 배지 1 ml을 넣고 피펫팅을 통해 cell pellet을 풀어줍니다.
9. 풀어준 세포와 Trypan Blue를 섞어 Hemocytometer나 counting 장비로 세포를 계수합니다. (계수 방법은 아래에 다시 설명)
10. 계수된 세포 수를 참조해 적정 세포 수를 각 실험에 알맞은 plate에 seeding한 후 잘 흔들어줍니다.
11. 세포가 골고루 퍼져 있는지 현미경을 통해 확인한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 incubation합니다.

 

 

 

세포를 계대하는 방법은 이렇게 마무리가 되며, 실험자의 손에 익숙해지기만 하면 크게 어려운 부분은 없습니다. 다만, 처음 실험을 접하는 사람들은 9번에서 가장 어려움을 느끼리라 생각합니다. 따라서 seeding할 세포를 계산하는 방법을 아래에 설명하겠습니다.

 

 

 

 

 

[세포 seeding 계산 방법]

 

우선 세포를 seeding하기 위해선 아래의 공식을 기억해야 합니다.

 

 

 

 

 

 

 

 

그리고 세포 seeding을 할 때 기본적으로 마주치는 2가지 상황을 예시로 계산하는 방법을 설명해보겠습니다.

 

ex 1) 90 mm dish에 배지 10 ml, 세포 2X10⁵ 만큼 seeding할 때

ex 2) 96 well plate에 well당 배지 100 µl, 세포 2X10³ 만큼 seeding할 때

 

 

 

 

 

 

세포 수를 counting하는 법은 보통 hemocytometer를 사용하는 방법과 counting 장비를 사용하는 방법으로 크게 나뉘어 지며, 각 실험실에 있는 도구를 사용하여 알맞게 계산하면 됩니다.

 

 

 

 

1. Hemocytometer

 

 

사진출처: https://bitesizebio.com/13687/cell-counting-with-a-hemocytometer-easy-as-1-2-3/

 

 

 

첫번째로 hemocytometer를 사용하는 방법입니다. 

위의 그림이 hemocytometer 이며 위와 아래쪽에 있는 홈에 Trypan blue와 cell을 희석해서 10 µl씩 분주한 후 현미경으로 가져가서 counting하면 됩니다. 희석 배율은 세포수에 따라 조절하면 되지만 우선 Trypan blue 10 µl과 cell 10 µl을 섞어서 2배 희석했다 가정해보겠습니다. 그리고 나서 F에 있는 설명처럼 자기만의 규칙을 세워서 counting하면 되는데 B, C, D, E 총 4면에 있는 세포수를 counting하면 됩니다. 4면을 counting해서 총 400개의 세포가 counting 되었다 가정해 보겠습니다. 그리고 나서는 공식에 따라 ex 1)과 ex 2)를 풀어보겠습니다.

 

 

 

 

ex 1)

 

 

→ 배지 9.9 ml + 8번 세포 100 µl = 총 10 ml

→ 잘 섞은 후 plate에 10 ml 전부 seeding하면 완료

 

 

 

 

 

ex 2)

 

 

→ 배지 9.504 ml (100 µl X 96 well - 96 µl) + 8번 세포 96 µl = 총 9.6 ml

→ 잘 섞은 후 well 당 100 µl씩 seeding하면 완료

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Cell counting 장비

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

사진출처: https://www.gaiascience.com.my/productdetails/luna-ii-automated-cell-counter, https://dawinbio.com/product-information/?q=YToxOntzOjEyOiJrZXl3b3JkX3R5cGUiO3M6MzoiYWxsIjt9&bmode=view&idx=12859951&t=board

 

 

 

 

 

 

 

 

두 번째로는 cell counting 장비를 사용하는 방법입니다. Counting 장비는 hemocytometer랑 마찬가지로 양 옆에 있는 홈에 Trypan blue와 cell을 희석해서 10 µl 씩 분주하면 되지만 수동적으로 counting할 필요 없이 장비에 넣게 되면 바로 1 ml당 내가 가진 cell 수를 표기해 줍니다. 장비에 넣고 counting한 live cell값이 1X10⁶ 이라 가정해본 후 공식에 따라 ex 1)과 ex 2)를 풀어보겠습니다.

 

 

ex 1)

 

 

→ 배지 9.8 ml + 8번 세포 200 µl = 총 10 ml

→ 잘 섞은 후 plate에 10 ml 전부 seeding하면 완료

 

 

 

 

 

 

ex 2)

 

 

 

 

→ 배지 9.408 ml (100 µl X 96 well - 192 µl) + 8번 세포 192 µl = 총 9.6 ml

→ 잘 섞은 후 well 당 100 µl씩 seeding하면 완료

 

 

 

 

 

위의 예시들은 정확한 이해를 돕기 위해 소수점까지 정확하게 표기한 것이며 실제 실험하시는 분들은 계산한 값에 딱 맞아 떨어지는 양보다 피펫팅 과정 등에서의 손실을 고려하여 넉넉하게 준비하시길 바랍니다. 세포 배양 시 항상 배지 오염을 조심하시기 바라며, 세포 실험을 시작하는 많은 분들께 도움이 되는 글이 되길 바래봅니다.