Transformation은 외부 DNA를 세포 내로 도입하여 유전자 발현이나 세포의 형질을 변화시키는 실험 방법으로, 일반적으로 박테리아, 효모, 식물 및 동물 세포에서 유전자를 도입할 때 사용됩니다. 

주로 사용하는 방법은 열충격법 (Heat shock), 전기천공법 (Electroporation) 및 화학적/생물학 적 방법으로 나뉩니다. 

 

하기에서는 CaCl₂를 이용한 competent cell 제조 방법과 transformation 방법 중 heat shock 방법 에 대해 알아보겠습니다.

 

 

 

 1. Competent cell 준비 

 

① 주요 준비물

    • 박테리아 배양액: E. coli (DH5α strain, BL21 strain 등) 

    • 0.1 M CaCl2 용액 

     • 멸균된 초저온 보관용 tube 

     • LB 배지 (Tryptone: 10 g/L, Yeast extract: 5 g/L, NaCl: 10 g/L) 또는 SOC 배지 (Tryptone: 20 g/L, Yeast Extract: 5 g/L, NaCl: 0.5 g/L, KCl: 2.5 mM, MgCl₂: 10 mM, MgSO₄: 10 mM, Glucose: 20 mM)

 

 

② 0.1 M CaCl2 용액 제조

 • CaCl₂·2H₂O의 분자량이 147.01 g/mol이므로, 1.47 g의 CaCl₂·2H₂O를 계량한 다음 계량한 CaCl₂·2H₂O를 초순수에 천천히 첨가하며 교반하다가 완전히 녹인 후, 최종 부피를 100 ml로 조정하여 제조

 

 

③ Competent cell 제조

 • 박테리아 배양: 한밤 배양한 박테리아를 10~20 ml의 LB 배지에 재접종하고 37°C, 180 rpm에서 배양한 다음 OD600이 0.4~0.6에 도달할 때까지 배양 (Log phase에서 competent cell 효율이 가장 좋음)

 • 세포 회수: 배양액을 멸균 원심분리관에 옮기고 원심분리 (4°C, 4000 rpm, 10분)한 다음 상등액을 제거하고 세포를 pellet으로 모음

 • 1차 CaCl₂ 처리: Pellet을 얼음 위에서 차가운 0.1 M CaCl₂ 용액으로 부드럽게 재현탁한 다음 30분간 얼음에서 보관하며 세포를 안정화

 • 2차 CaCl₂ 처리: 원심분리 (4°C, 4000 rpm, 10분)하여 CaCl₂를 제거하고, 다시 차가운 0.1 M CaCl₂ 용액으로 세포를 재현탁한 다음 15~30분 동안 얼음에서 보관

 • 글리세롤 첨가 및 저장: Competent cell을 초저온 보관용으로 준비하려면, 15% 글리세롤 을 첨가하여 혼합한 다음 -80°C에서 보관

 

 

■ Competent cell 제조 시 주의사항 

 • 저온 유지: 세포의 효율을 높이기 위해 모든 과정을 얼음 위에서 작업  Contamination 방지: 작업 전후 멸균된 도구와 용기 사용. 

 •  최적 농도 조절: OD600이 너무 높거나 낮으면 효율이 떨어짐. 0.4~0.6 사이 유지 

 •  빠른 사용: Competent cell 은 제조 후 가능한 빠르게 사용하는 것이 효율적 

 •  보관 조건: 장기 보관 시 글리세롤을 첨가해 초저온 상태에서 보관 

 

 

 

 

3. Transformation 

 다음의 조건으로 transformation을 실시합니다.

 

 

 

[Step 1] Competent cell 준비 

 

 •  박테리아에 CaCl₂ 같은 divalent cation을 처리하여 세포막의 인지질 구조를 불안정하게 만들며, 이는 외부 DNA가 세포 내로 들어가도록 세포를 준비시키는 과정입니다. 

 •  얼음 위에 얼려진 competent cell을 녹인다 (약 3~5분)

 

 

[Step 2] Plasmid DNA와 혼합 

 

 •  Competent cell에 plasmid DNA를 첨가하고, 얼음 위에서 30분간 보관하여 DNA가 세포 와 결합하도록 합니다. Plasmid DNA를 혼합할 때는 pipetting 하지 말고, 튜브를 가볍게 tapping해 줍니다.

 

 

 

[Step 3] Heat shock

 

 •  42°C에서 30~90초간 세포를 가열하여 세포막에 일시적인 구멍을 생성시켜 외부 plasmid DNA가 세포 내로 들어가게 하는 과정입니다.

 

[Step 4] 복구 및 배양

 •  얼음 위로 튜브를 다시 이동하여 세포를 안정화시키며, 250 μl의 LB 배지나 SOC 배지를 추가해 37°C에서 1시간 동안 배양한 다음 항생제가 포함된 plate를 사용해 형질전환된 세포만 선택적으로 배양시킵니다.

 

 

                     

 

 

이상으로 transformation 방법에 대해 알아보았습니다. 

 

 필요한 배지 제조 시 문제가 있거나, 실험에 적합한 배지를 선택하는데 도움이 필요하시면 연락 주세요!!