세포를 동결하는 주된 목적은 장기 보존입니다. 세포를 동결하면 연구에 필요한 세포의 특정 유 전적 특성과 생리적 상태를 유지하면서 언제든지 다시 사용할 수 있습니다.

 

 

■ 준비물

• 세포 : 동결할 세포 

• 동결배지 : 90%FBS+10%DMSO, Freezel, CryOPT-L, CryOPT-Z 와 같은 Freezing media 

• Cryotube : 멸균된 동결 바이알 - 냉각기기 or Freezing container 

• 액체질소 탱크 - Water bath 

• 기타 : 피펫, 팁, 배양배지, Trypsin, PBS, Trypan blue, 세포 계수기, 원심분리기

 

 

■ 동결 

 

 1. 세포 수확 

 1) 70~80% 정도 찬 세포를 준비합니다. 

 2) 세포를 PBS로 세척한 후 Trypsin을 처리한 채로 Incubator에 넣고 5분 정도 기다려줍니다. (부유세포의 경우 이 과정 생략) 

 3) 배양배지로 Trypsin을 중화시키면서 세포를 수집합니다. 

 

 

2. 세포 계수 

 1) 수집한 세포를 Trypan blue를 통해 살아있는 세포 수를 확인합니다. 

 2) 일반적으로 한 바이알당 1~5X106cells/mL의 세포가 들어가도록 계산합니다. 

 3) 계산한 만큼의 세포를 따서 각각의 tube에 분주합니다. 

 4) 분주한 부착세포 및 부유세포를 원심분리기를 통해 상층액과 세포펠렛으로 분리합니다. 5) 상층액은 제거합니다.

 

 

3. 동결 준비 

 1) Cryotube에 세포종류, Passage number, 세포농도, 동결날짜 등 필요한 정보를 라벨링합니다. 

 2) 동결배지 1mL씩 세포 펠렛에 넣어준 후 피펫팅을 통해 세포를 부드럽게 풀어줍니다. 

 3) 세포 1mL을 Cryotube에 옮겨 담습니다.

 

 

4. 동결

 1) 냉각기기가 있는 경우 -1°C/min 속도로 서서히 동결한 후 -80°C까지 도달하면 액체질소로 이동합니다. 

 2) 냉각기기가 없는 경우 Freezing container에 바이알을 넣은 후 -80°C에서 overnight하고 액체 질소로 이동합니다.

 

 

 

■ 해동

 

1. 세포 해동

 

 1) 37°C Water bath에 바이알을 넣고 빠르게 흔들며 해동합니다. (30초~1분) 

 2) 세포가 완전히 녹으면 즉시 원심분리해줍니다. 

 3) 상층액을 제거해준 후 배양배지를 넣고 섞어줍니다. 

 

 

2. 세포 배양

 

 1) 세포를 Trypan blue를 통해 살아있는 세포 수를 확인합니다. 

 2) 배양할 plate크기에 맞게 seeding할 세포를 계산한 후 그만큼의 세포를 따서 배양배지가 담 긴 plate에 분주합니다. 

 3) 세포가 뭉치지 않도록 잘 흔들어서 섞어준 후 Incubator에 넣어 배양합니다. 4) 24시간이 지난 후 필요에 따라 배양배지를 교체해 줍니다.

 

 

 

 

 

■ 실험 팁

- 세포를 동결하기 전에는 건강한 상태의 세포를 동결해야 손상 가능성이 줄어듭니다.

- 세포를 얼리거나 녹일때는 최대한 빠르게 진행하여 세포 스트레스를 줄입니다.

- DMSO를 포함한 동결배지는 사용 전에 4°C로 냉각하여 세포 스트레스를 줄입니다.

- DMSO는 세포독성을 가짐으로 해동 후 가능한 빨리 제거 혹은 DMSO 없거나 적은 제품을 사용 합니다. 

- 액체질소에 보관할수록 세포 품질을 오래 유지 가능합니다.

- 동일한 세포를 여러 바이알에 나눠 보관하여 손실의 위험성을 줄일 수 있습니다.

- 해동 후 세포를 Plating 했다면 현미경으로 Plating 직후, 하루 뒤 등 자주 확인해줍니다.