Pluripotent Stem Cell (PSC)은 체내 거의 모든 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 줄기세포로, 배아줄기세포(ESC) 와 유도만능줄기세포(iPSC) 로 나뉩니다. 

특히 iPSC는 체세포에 특정 유전자를 도입하여 분화 전 상태로 되돌린 세포로, 윤리적 논란이 적고 환자 맞춤형 치료에 사용될 가능성이 높아 연구와 활용도가 빠르게 확장되고 있습니다. 

 

 iPSC 는 자가재생 능력과 다분화능을 가지며, 올바른 배양 환경과 조건에서 안정적으로 유지 및 증식이 가능합니다. 

하지만 세포 배양 중 분화 또는 환경 변화에 민감하기 때문에, 정확한 배양 및 유지 프로토콜이 필수적입니다.

 

 

■ PSC 계대 배양 방법

 

STEP 0: 준비물

    •  세포(iPSC 또는 ESC): Cryopreserved PSC (동결된 PSC) 또는 기존에 배양 중인 PSC

    •  코팅된 배양 플레이트: Matrigel 또는 vitronectin으로 코팅된 cell culture plate 

    •  배양 배지: mTeSR™ Plus, Essential 8™ 등 PSC 배양에 적합한 정의된 배지 

    •  EDTA (0.5 mM, PBS에 희석)  DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 없음)

 

 

 

 

STEP 1: PSC 해동 및 초기 배양 

    1) 동결된 iPSC를 37℃ Water bath에서 빠르게 해동합니다. (2~3min) 

    2) 세포가 완전히 해동되면 15 ml 원심분리 튜브에 옮기고, 10 ml 의 pre-warmed 배양 배지를 천천히 추가합니다. 

    3) 200 g 로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 

    4) 세포를 적정 배양 배지로 재현탁하여 코팅된 플레이트에 도포합니다. → 배양 배지에 코팅제를 직접 첨가하는 경우에는 제품의 권장 농도만큼 코팅제를 배양 배지에 함께 넣고 흔들어준 후 37℃ 의 incubator 에 30분간 두었다가 세포를 도포합니다. 

    5) 인큐베이터에 배양하며, 24시간 후 fresh한 배지로 교체합니다.

 

 

 

 

STEP 2: PSC 유지 및 배지 교환 

    1) 배지 교환: 다음 계대 진행까지 매일 배양 배지를 교환합니다.

    2) 배지 교환 시, 2-3 ml (6-well 기준)의 신선한 배양 배지를 사용합니다. 

    3) 현미경을 통해 세포 상태를 확인하며, 세포 집락의 크기와 모양이 유지되는지 관찰합니다. 

    → PSC 는 선명하고 경계가 명확하며 둥근 집락 형태를 가져야 합니다. 

    → 분화 징후(예: 경계가 흐리거나 섬유질 구조)는 없도록 관리합니다. 

                                 

 

 

 

 

STEP 3: 세포 계대 (Passaging)

    1) 집락이 약 70-80% confluent에 도달하면 계대를 수행합니다. 

    2) 세포를 DPBS 로 1 회 세척한 후, EDTA 0.5 mM 용액을 추가하여 37℃에서 5~8 분간 배양합니다. (single cell 로 분리되어 잘 떨어질 때 까지) 

    3) 신선한 배지를 추가하여 세포를 부드럽게 pipetting하여 분리합니다. 

    4) 분리된 세포를 새로운 코팅된 플레이트에 희석하여 도포합니다. 5) 적정 배양 농도는 1:6~1:12 비율로 설정합니다.

 

 

 

 

주의사항 및 문제 해결법 

    1) PSC는 매우 민감하므로, 배지 교환 시 세포를 과도하게 자극하지 않도록 주의합니다. 

    2) 세포 집락에 분화 징후가 보이면 즉시 제거하거나 배양 조건을 재검토합니다. 

    → 집락에 분화가 발생할 경우, 분화된 부분은 pipette tip으로 제거합니다. 

    → 배지 성분(예: bFGF 농도)을 검토합니다. 

    → 배양 환경(온도, CO₂ 농도, 습도)을 지속적으로 유지하며, 오염 방지를 위해 멸균 작업대를 사용합니다. 

    3) 성장이 저하될 경우, 플레이트 코팅 상태와 초기 세포 접종 밀도를 조정합니다.