■ 실험목적 

 카바졸법(Carbazole Assay)은 우로닉산(Uronic acid)과 황산을 기반으로 하는 발색 반응을 이용한 정량적 분석 기법입니다. 

이 방법은 우로닉산의 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid) 포함하는 화합물의 농도를 정량분석하기 위함입니다.

 

 

■  필수 장비 및 시약

 

1. 장비:

    • 분광광도계(UV Spectrophotometer) 

    •  온도 조절 가능한 가열 블록(55~60°C) 

    •  피펫 및 피펫 팁 

    •  Water bath 

    •  96well-plate 

    • 10mL glass test tube 

    •  Stainless tube racks

 

 

 

2. 시약:

    •  황산(sulfuric acid, ≥98%) 

    •  카바졸(Carbazole) 

    •   표준품(D-Galacturonic acid) 

    •   초순수 

    •   0.125% EtOH

 

 

3. 안전 장비:

    •  보호 안경 및 실험용 장갑 

    •  환기 시스템

 

 

 

■ 프로토콜

 

1. 표준 용액 준비

    •  표준품을 1 mg/mL 농도로 초순수에 용해하여 준비합니다. 

    •  10, 30, 50, 70, 90 µg/mL 농도로 희석한 표준 곡선 용액을 제작합니다.

 

 

2. 시약 준비

    •  황산 용액 준비: 반드시 후드에서 작업하며 소량을 용기에 필요한 양만 준비합니다. 

    •  카바졸 용액 준비: 50ug/mL 농도의 카바졸 시약을 0.125% (w/v) 에탄올에 용해하여 반응 직전에 준비합니다.

 

 

3. 샘플 준비 

    •  분석 대상 샘플을 원심분리 또는 여과하여 불순물을 제거합니다. 

    •   샘플의 흡광도 값이 10 ~ 90 µg/mL 범위 안에 들어오도록 희석하여 조정합니다.

 

 

4. 반응 단계

 

    •  반응 혼합물 준비: 

           1. 10mL glass test tube 에 200 µL 의 샘플 또는 표준품 용액을 첨가합니다. 

           2. 1.2 mL 의 황산을 천천히 추가하며 용액이 혼합되도록 합니다. 

           3. 시약 혼합물을 실온까지 완전히 냉각시킨 후 카바졸 용액을 첨가합니다.

 

    •  가열 반응: 

           4. Water bath 의 온도를 55~60°C로 설정합니다. 

           5. 혼합물을 stainless tube rack 에 고정하여 water bath에 함께 침지시켜 10 분 동안 가열하여 반응을 진행합니다. 

           6. 반응 종료 후 실온에서 혼합물을 5분간 냉각시킵니다.

 

 

5. 흡광도 측정

    •   준비된 혼합물 샘플 용액과 표준품 용액을 96well-plate에 분주하여 분광광도계에 옮기고 530 nm에서 흡광도를 측정합니다.

 

                                                   

 

 

 

 

■ 주의사항 

 

          1. 안전 관리: 황산은 매우 부식성이 강하므로 작업 중 보호 장비를 착용하고, 사용 후 폐액은 적절히 처리해야 합니다. 

          2. 온도 제어: 가열 온도가 55~60°C를 초과하지 않도록 주의하십시오. 과열 시 발색 반응이 왜곡될 수 있습니다.