T-flask배양:
	1. 혈청이 포함된 배지에 배양된 대수증식기(log phase)의 hybridoma 세포를 1,500 rpm에서 5분간 원심한다.
	2. 상층을 제거하고 세포 침전물을 37°C에서 항온된 serum-free media 또는 protein-free media로
	pipet을 이용하여 잘 현탁한다.
	3. 초기 세포농도를 2 ~ 5 x 105 cells/ml 로 하여 새로운 T-flask로 옮긴다.

	* 최적 배양 배지 부피   T-25 flask  5 - 10 ml  T-75 flask  15 - 25 ml   T-175 flask  35 - 50 ml

	* 혈청배지에서 배양된 cell을 serum-free 또는 protein-free media에 처음으로 배양할 때는       초기세포농도를 가능한 높게(4 x 105 cells/ml 이상) 시작하는 것이 좋다.
	4. CO2 배양기 (5% CO2, 95% air)에서 정치 배양 한다.
	CO2 배양기를 사용하지 않고 일반 BOD 배양기를 사용하기 위해서는 1 M HEPES 용액(JBI, Cat. NO. BB 001-01)을
	첨가하여 15 - 25 mM 되게 한 후 배양한다.
	5.세포 농도가 1.5 x 106 cells/ml (1:5 - 1:10 계대 배양 후 2~4일) 전후에 도달되면 계대배양 한다.
	6 계대 배양할때는 배양액 20%에 새로운 배지 80%를 넣어 1:5로 계대배양하며, 3 - 4회 계대 배양할 때마다 전체 배지를          새로운 배지로 바꿔주는 것이 바람직하다.
	* 세포 생존도 (cell viability)가 70% 이하일 경우에는 저속원심 (800 rpm, 5 min)하여 상층을 제거하고 새로운 배지로           잘 현탁한 후 배양한다.
	Spinner flask 배양:
	1. 1. 혈청이 포함된 배지로 T-flask 에서 배양된 대수증식기(log phase)의 hybridoma 세포를 1,500 rpm에서 5 분간 원심
	2. 2. 상층을 제거하고 37°C에서 항온된 serum-free media 또는 protein-free media로 세포 침전물을
	pipet을 이용하여 잘 현탁시킨다.
	3. 초기 세포농도를 4 - 6 x 105 cells/ml 로 하여 spinner flask로 옮겨 배양한다.

* 최적 배양 배지 부피
250 ml spinner flask	80 - 110 ml
500 ml spinner flask	180 - 250 ml
1 L spinner flask	350 - 500 ml
3 L spinner flask	600 - 1200 ml

	4. 혈청 배지에서 배양된 세포를 serum-free media 또는 protein-free media에 처음으로 배양할 때는 초기 세포 농도를          가능한 높게(4 x 105 cells/ml 이상) 시작한 후 3회 정도 같은 초기 세포 농도로 계대 배양하여 세포 생존도가 높고          (90% 이상) 세포성장이 비슷하면 (최대 세포 농도가 1.5 - 3 x 106 cells/ml) 초기 세포 농도를 2 - 4 x 105 cells/ml          사이로 하여 배양한다.
	5. CO2 배양기 (5% CO2, 95% air)에서 40 rpm 으로 교반하면서 배양한다.          * CO2 배양기를 사용하지 않고 일반 BOD 배양기를 사용하기 위해서는 1 M HEPES 용액(BB 001-01)을 첨가하여           15 - 25 mM 되게 한 후 배양한다.
	6. 세포 농도가 1.5 x 106 cells/ml (1:5 - 1:10 계대 배양 후 약 2 - 4일) 전후에 도달되면 계대 배양 한다.
	7. 계대 배양할때는 배양액 20%에 새로운 배지 80%를 넣어 1:5로 계대 배양하며, 3 - 4회 계대 배양 할 때마다          전체 배지를 새로운 배지로 바꿔주는 것이 좋다.
	* 세포 생존도(cell viability)가 70% 이하일 경우에는 저속원심 (800 rpm, 5 min)하여 상층을 제거하고 fresh media로          잘 현탁한 후 배양한다.
	* Spinner flask를 이용하여 세포배양을 할 때에는 원활한 기체 교환을 위해서 양쪽 뚜껑을 1/4정도 열어서 배양한다.
	* 배양 중간에 pH를 측정하여 pH 가 6.9 - 7.0 이하일때에는 0.5 N NaOH (LS 012-01) 또는 7.5% NaHCO3 (BB 002-01)를          0.5 - 1 ml/100 ml 배지에 첨가하여 조정한다.       * Serum-free media 또는 protein-free media를 이용하여 hybridoma 세포를 배양하여 항체를 생산할 때에는          세포 생존도가 떨어져도 항체 생산은 지속되므로 세포 생존도가 30 - 40% 일때까지 배양하여도 된다.
	항체 생산을 증가시키기 위해서는 필요하다면 serum-free media, protein free media에 다음 첨가물을 추가로 첨가한다.

Product Name	JBI Product(Cat. No.)	Using Volume(/L)
D-Glucose solution	LS 001-01 or LS 001-02	2.5 - 10 ml
L-Glutamine solution	LS 002-01	50 - 100 ml
MEM amino acid solution	LS 004-01	20 - 40 ml
MEM Non-essential amino acid solution	LS 005-01	10 - 20 ml
MEM vitamin solution	LS 006-01	10 - 20 ml
Sodium pyruvate	LS 013-01	10 - 20 ml
Pluronic F-68 Solution	LS 105-01	10 ml