바이오 산업, 특히 세포치료제나 배양육 산업에 대한 관심이 날로 늘어가는 상황에서 기존의 동물혈청을 이용한 세포배양 배지는 동물윤리, 외래성 오염인자 및 관련 규제의 어려움 등으로 무혈청, 무단백 배지로의 대체 필요성이 갈수록 높아지고 있습니다.
이번에는 이런 무혈청(Serum-free), 무단백(Protein-free) 세포배양 배지의 역사, 장단점에 대해 알아보겠습니다.
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Serum-Free Media와 Protein-Free Media의 역사
1950년대에 합성 배지로 자연 배지를 부분적으로 대체할 수 있다고 보고된 이후로 혈청 공급 없이 세포 배양을 하려는 시도는 꾸준히 있어왔고, 현재는 다양한 무혈청·무단백 배지가 개발되어 상용화되어 있습니다.
대표적으로 Ham’s medium, NCTC 109, 135, Waymouth's MB752/1, MB705/1, Brich & Pirt media, Higuchi media, MCDB media 등의 배지를 사용하여 혈청의 첨가 없이 세포의 성장을 유지할 수 있으며 대부분 이들 배지에 insulin, EGF (epidermal cell growth factor), albumin, transferrin, polyamine, fatty acid 등을 첨가하여 사용하며, 철을 수송하는 단백질인 transferrine 대신에 iron citrate, iron chelating reagent를 첨가하여 단백질 성분을 전혀 함유하지 않은 protein-free media도 개발되었습니다.
WELGENE에서는 hybridoma 세포, CHO 세포, 곤충 세포를 위한 Serum-free media와 Protein-free media를 공급하고 있으며, MSC를 포함한 줄기세포나 그 외 특수세포를 위한 다양한 SF, PF media를 연구개발하고 있습니다.
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Serum-Free Media와 Protein-Free Media의 장점
동물혈청 배지는 Serum-Free Media 또는 Protein-Free Media에 비해서 세포 증식에 더 용이하지만 혈청 배지의 주요한 첨가제인 혈청은 아래와 같은 단점을 갖고 있습니다.
1)혈청의 조성은 아직까지 밝혀지지 않은 미지의 미량 성분들이 있으며 이들이 세포의 성장에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 배지 성분이 완전히 밝혀져 있고 혈청을 첨가하지 않는 Serum-Free Media와 Protein-Free Media는 재현성 있는 실험이 가능합니다.
2)혈청은 채취 시기와 채취 장소에 따라 성분의 변화가 있을 수 있어 재현성 있는 실험을 위해서는 같은 lot의 혈청을 대량으로 준비해야 하며, 미리 준비하지 못한다면 다른 lot의 혈청에 대해 광범위한 검사를 시행하여 이전의 혈청과 비교해야 하는 불편함이 있습니다.
3)혈청은 동물에서 채취되므로 동물의 병원성 또는 기타 요인에 오염될 수 있어 실험에 영향을 미칠 수 있습니다. 특히 이점은 의약품, 식품 등의 관련 규제가 더욱 까다로워질 수 있는 문제점을 야기할 수 있습니다.
4)혈청은 매우 복잡한 산물이므로 세포 배양 후 배양 산물을 이용하고자 할 때 혈청 성분들을 제거하기 어려워 다음 공정 과정이 제한되는 경우가 많습니다.
5)혈청은 전량 수입에 의존하는 매우 비싼 가격의 제품이며, 수요가 많아지면 공급 또한 원활하지 못할 수 있습니다.
따라서, Serum-Free Media와 Protein-Free Media를 배양에 사용하게 되면 위와 같은 혈청의 단점을 보완할 수 있습니다.
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Serum-Free Media와 Protein-Free Media의 단점
혈청 배지를Serum-Free Media 또는 Protein-Free Media로 전환하는 것이 더 바람직하고 장점도 많지만 아래와 같은 단점이 있어 많은 세포에 적용하기에는 어려운 점이 있습니다.
1)세포의 종류마다 각기 다른 종류의 배지를 필요로 하며 또한 각기 다른 방법으로 배양해야 합니다. 즉, Serum-Free Media 또는 Protein-Free Media에서 배양 가능한 세포가 매우 제한되어 있습니다.
2)혈청 내에는 해독작용을 하는 여러 인자가 함유되어 있으나, SF Media와 PF Media에는 해독작용을 하는 혈청이 없으므로 시약과 물의 순도 및 기자재의 청결성이 엄격히 유지되어야 합니다.
3)Serum-Free Media 또는 Protein-Free Media의 일부 구성성분은 상용화되어 있지 않아서 실험실에서 만들어 사용해야 합니다.
4)Serum-Free Media 또는 Protein-Free Media를 사용할 수 있는 세포주는 제한되어 있고, 혈청 배지에 비해서 그 생존률이나 성장률이 낮아지는 경우도 있습니다.
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혈청 대체 성분
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단백질 분해 효소 억제제(protease inhibitor)
일반적인 세포배양 시 Trypsin으로 처리하여 계대배양 후에 혈청을 추가하면 남아있는 단백질 분해 작용을 억제하게 됩니다. 따라서, 혈청을 사용하지 않는 후 SF Media 또는 PF Media를 사용할 때는 soybean trypsin inhibitor나 aprotinine과 같은 단백질 분해 효소 억제제를 추가해야 합니다.
SF Media 또는 PF Media를 이용하여 배양하고자 할 때 첨가하는 호르몬들로는, 성장 호르몬, insulin, hydrocortisone, 5-triiodo thyronine (T3), estrogen, androgen, progesterone, prolactin 등이 있습니다.
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펩티드 성장 인자(peptid growth factor)
생체 외에서 세포증식을 촉진하는 polypeptide group에 속하는 것들은 현재 매우 광범위하며, heparin-binding growth factor, fibroblast growth factor (FGF), epidermal cell growth factor (EGF), platelet derived growth factor (PDGF), Insulin-like growth factor (IGF-1, IGF-2), interleukin등을 들 수 있습니다.
일부 미량 무기물질의 필요성에 대한 증거가 확실하지는 않지만 철분, 구리, 각종 무기물질들을 SF Media 또는 PF Media의 구성성분으로 포함시켜왔습니다. 20nM 정도의 selenium이 대부분의 SF/PF Media에 포함되어 있고 lipid나 lipid 전구물질인 choline, linoleic acid, ethanolamine, phosphorylethanolamine 등도 일부에서 필요로 할 수 있습니다.
BSA나 조직 추출물을 첨가하면 세포 성장과 생존율을 증가시키지만 BSA나 조직 추출물은 여러 단백질이 함유되어 있으므로 배지에 비규정 성분이 포함되는 결과를 초래하게 됩니다. 그러나, Serum-Free Media에는 지방산이 없는 BSA를 1-10 mg/ml 되게 첨가하여 사용하기도 하며, iron에 대한 운반체로 작용하는 Transferrin은 약 10 ng/ml로 사용됩니다.
