Starvation 실험 시  glucose는 제거해야 하나요?


1. Serum starvation
가장 흔히 쓰이는 방법으로 FBS만 제거하고, 기본 배지 성분(Glucose, Amino acids, Vitamins)은 그대로 유지
혈청 내 성장인자(EGF, IGF, FGF 등) 자극을 차단하는 목적으로 세포를 동기화(G0/G1 정지)하여 특정 자극 후 반응을 보도록 준비하는 과정
       → 이 경우 glucose는 제거하지 않음

2. Nutrient starvation
세포의 특정 대사 경로를 연구할 때는 Glucose를 포함한 특정 영양소를 제거하기도 함
      - Glucose starvation: 세포의 glycolysis, AMPK/mTOR 반응, autophagy 활성 관찰
      - Amino acid starvation: 특히 glutamine, leucine 결핍 → mTORC1 신호 연구에 활용
      - Serum + glucose double starvation: 극단적 스트레스 모델 (예: apoptosis, autophagy 촉진 연구)

● 주의사항
Glucose를 완전히 제거하면 세포가 빠르게 죽거나 stress가 과도할 수 있음. 즉, 일반적인 cell line은 몇 시간 내 viability가 급격히 떨어짐
그래서 보통 단시간(2–6시간 정도) 처리하거나, 저농도 glucose (예: 0.5–1 g/L) 조건으로 부분 starvation을 함
목적에 따라 time-course 최적화 필요

Poloxamer 188 - 독성 또는 세포 스트레스 완화 외 효과는? 


● 세포 보호 효과 (Shear protection)
    → 세포배양(특히 부유세포, suspension culture)에서 교반·기포 발생으로 인한 mechanical shear stress가 세포막을 손상시킬 수 있음. 
        Poloxamer 188은 계면활성제로서 세포막에 흡착해 막 안정화(membrane stabilization) 역할을 하고, 기포 표면장력을 낮춰 세포 손상과 사멸을 줄여줌.
        따라서 CHO, HEK293, Hybridoma 등 단백질/항체 생산 세포주에서 흔히 사용됨

● 세포막 sealing 효과
     → 세포 손상 시 생기는 plasma membrane lesion에 흡착해 빠른 sealing을 유도
     → 외상/허혈 모델에서 세포 보호제(cytoprotective agent)로 연구됨
     → 줄기세포·근육세포 연구에서 세포막 안정화제로 자주 인용됨

● 배양액 안정화
     → 기포 억제(antifoaming) 효과로, 대규모 바이오리액터에서 배양액 안정성 제고
     → 단백질이 계면에서 변성되는 것을 억제하여 단백질/항체 생산 수율 향상

● 의약품 제형에서의 역할
     → 주사제/단백질 제제에서 solubilizer & stabilizer로 사용
     → 단백질 응집·변성을 억제, 약물 용해도 향상
     → FDA에서도 비독성 보조제로 인정, 상용화된 제형 다수 존재

● 기타 연구효과
     → 허혈-재관류 손상 모델에서 심근세포 보호
     → 근이영양증, 세포막 결손 질환 등에서 치료 후보로 연구

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Poly-D-Lysine - 세포 생존에 영향을 주지는 않나요?


● 긍정적 효과
      - 접착력이 약한 세포에서 생존율 제고
      - 뉴런, iPSC-derived neuron, primary hippocampal neuron 등은 PDL 코팅이 없으면 쉽게 apoptosis 발생
      - 부착 안정화는 downstream 실험(분화, 시그널링, 전기생리학 분석 등) 재현성에 필수적

● 잠재적 부정 효과
      - 고농도 사용 시 세포막에 비특이적 결합을 하여 세포 스트레스/독성 유발 가능
      - 코팅 후 세척 불충분 시, 표면에 남은 잔여 PDL이 세포 viability에 영향을 줄 수 있음

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● Ca²⁺/Mg²⁺는 cadherin·integrin 같은 접착 단백질의 활성 유지에 필요한데, 이온이 있으면 세포-세포/세포-기질 접착이 강해져 해리가 어려움
     그래서 trypsin 같은 효소는 보통 Ca²⁺/Mg²⁺가 없는 HBSS에 녹여 사용 
    → 따라서 Ca²⁺/Mg²⁺ free HBSS는 세포 접착을 약화시켜 효소 작용을 도와 세포 해리가 더 잘 일어남

● 해리 후 세포를 다시 ECM(Extracellular Matrix)에 붙이거나 기능을 유지할 때는 Ca²⁺/Mg²⁺가 포함된 HBSS를 사용
     해리 과정 → Ca²⁺/Mg²⁺ free HBSS, 해리 후 세포 안정화 → Ca²⁺/Mg²⁺ containing HBSS

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 ● PH 지시기능
     - pH  8.2 → 분홍-진홍색 (알칼리성)
     - pH 7.0 ~ 7.4 → 주황-빨강 (정상 범위)
     - pH > 8.2 → 분홍-진홍색 (알칼리성)

● 세포 상태/배양 환경 모니터링
     ① 세포가 대사활동을 하면서 젖산 등 산성 대사산물을 배출하면 배지 색이 점점 노란색으로 변함 
          → 배지를 교환해야 할 시점을 시각적으로 알려줌
     ② 세포가 잘 성장하지 않거나 오염이 있으면, pH 변화 속도가 달라져 색 변화를 통해 간접적으로 확인할 수 있음

● 완충역할(부차적)
     ① Phenol red 자체는 미약하지만 산-염기 완충 작용을 가지고 있어, pH 변화에 약간의 저항성 부여
     ② 하지만 실제 주요 완충 기능은 NaHCO₃–CO₂ 시스템 및 HEPES 등이 담당

● 호르몬 유사활성
     ① Phenol red는 약한 에스트로겐 유사 활성을 가질 수 있음
     ② 따라서 호르몬 반응 연구(예: estrogen receptor assay, 유방암 세포주 연구)에서는 Phenol red-free 배지를 사용하는 것이 표준

● 유연한 배지 조성 설계
    ① 세포마다 필요한 아미노산/비타민 농도가 다름
    ② MEM, RPMI, DMEM 등 기본 배지 조성은 다르므로, 연구자가 원하는 대로 필요한 조합만 선택적으로 첨가할 수 있도록 따로 제공.
        → 예: 어떤 실험에서는 NEAA(Non Essential Amino Acid)가 필요 없지만, 특정 세포주(예: Hybridoma)는 NEAA가 있으면 성장률 제고됨

● 안정성 및 보관 편의성
    ① 아미노산과 비타민은 일부가 빛/온도에 불안정
    ② 모든 것을 한 번에 혼합하면 장기 보관 중 분해되거나 침전 발생 가능성이 있어 안정성을 고려해 별도 고농축 용액(100×)으로 제조하고 사용 직전에 배지에 소량 첨가

● Lot-to-lot 재현성 확보
    ① FBS 같은 혈청은 undefined component라 실험마다 결과 차이가 큼
    ② 반대로 defined supplement(아미노산/비타민)는 농도를 정확히 정의하고, stock으로 보관/사용이 가능하여 실험 결과에 대한 재현성 제고

● 특정 실험 목적에 맞는 보정
    ① 대사 연구: 특정 아미노산 결핍 조건을 만들 때, amino acid solution을 빼고 실험
    ② 분화 연구: 특정 비타민(A, C 등)이 분화에 영향을 주므로, vitamin solution을 조절
         → 이렇게 연구 목적에 따라 추가/제외/농도 조절이 가능

● Insulin
    ① 세포 표면의 인슐린/IGF receptor를 활성화시켜 포도당 섭취 및 대사 촉진
    ② 단백질, 지질 합성 및 세포 생존 촉진
    ③ 무혈청 조건에서 세포 성장과 증식 유지에 핵심

● Transferrin
    ① 철(Fe³⁺) 운반 단백질로서 DNA 합성과 미토콘드리아 효소에 필요
    ② 세포 내 철 독성을 막고 안정적 철 공급
    ③ 혈청 없는 조건에서 철 결핍 방지

● Selenium (보통 Na₂SeO₃ 형태)
    ① Glutathione peroxidase 등 항산화 효소의 보조인자
    ② 산화스트레스를 감소시켜 세포 생존율 향상
    ③ 특히 장기 배양 시 ROS 축적을 억제해 안정성 제고

● Pyruvate (Sodium Pyruvate)
    ① 세포의 에너지 대사(ATP 생산)에 직접 기여하고, 항산화 작용(ROS 제거)에도 일부 관여
    ② 따라서 무혈청 조건에서 세포가 에너지 스트레스를 덜 받도록 보완하는 목적

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● PBS는 단순한 완충액이지만, 보관 조건에 따라 침전물이 나타날 수도 있음

     ① Phosphate와 금속 이온 결합: PBS는 NaCl, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄로 구성되는데, 
          보관 중 용기/환경에서 Ca²⁺, Mg²⁺, Fe³⁺ 등 미량 금속 이온이 유입되면 불용성 인산염 침전(Ca₃(PO₄)₂, Mg₃(PO₄)₂)이 생길 수 있음.
          특히 Ca²⁺/Mg²⁺가 첨가된 PBS는 장기간 보관 시 침전이 잘 생김

      ② pH 변화: 시간이 지나면서 CO₂ 용해로 인해 pH가 약산성화되면 일부 인산염의 균형이 깨지게 되어 침전 발생

      ③ 농도와 온도 영향: 고농도 PBS (10×)는 온도 변화(특히 냉장 보관 시)에서 NaCl 결정이나 인산염 결정이 생길 수 있음. 
           보통 1× PBS는 상온 안정성이 높지만, 고농축 PBS는 침전이 흔함

      ⑤ 오염: 멸균이 불완전하면 세균·곰팡이 성장 부산물이 혼탁/침전처럼 보일 수 있음


● 대처방법

      ① 멸균 여과 (0.22 μm filter) 후 보관: 금속 이온/오염 최소화

      ② 10× stock PBS는 실온 보관 권장: 냉장하면 NaCl 및 인산염 결정 침전 가능

      ③ Ca²⁺/Mg²⁺ 포함 PBS는 필요 직전에 제조하거나 단기간만 사용

      ④ 침전이 보이면 폐기가 원칙: 성분 비율이 달라져 세포/실험에 예기치 않은 영향 끼침

● Ca²⁺은 cell adhesion에 있어 이중적인 (dual) 역할을 함

● Ca²⁺ 의존성 세포 간 접착을 위해 cadherin 계열 분자에 직접적으로 필요

● 세포외기질 (ECM) 및 다른 세포와의 접착을 매개하는 integrin의 기능과 활성화를 조절하는 데에도 관여 (Mg²⁺ 포함)

● 세포외 신호에 의한 integrin 활성화는 Ca²⁺의 유입을 유도할 수 있으며, 이는 integrin의 ligand 결합 능력에 영향을 미쳐 접착과 세포 이동을 조절하는 feedback loop를 형성

● LS (Low-Serum) MSC media
→ RS 001-01 (Containing FBS) ▶ 관련 제품 링크
→ RS 001-02 (Without FBS)  ▶ 관련 제품 링크
① 적은 혈청으로 줄기세포 배양이 가능
② 줄기세포 분화능, MSC marker 유지


● XF (Xeno-free) MSC media
→ RS 001-03 ▶ 관련 제품 링크
① 이종 동물유래 혈청 사용을 대체한 배양액
② 줄기세포 분화능, MSC marker 유지
③ 향상된 줄기세포 증식률


● CD (Chemically-defined) MSC media 
→ RS 001-10 ▶ 관련 제품 링크
① Animal-origin free(AOF) · Chemically defined (CD)
② 줄기세포 분화능, MSC marker 유지
③ 향상된 줄기세포 증식률


● Non-coated CD MSC media
→ RS 001-20 ▶ 관련 제품 링크
① Animal-origin free(AOF) · Chemically defined (CD)
② 줄기세포 분화능, MSC marker 유지
③ 향상된 줄기세포 증식률
④ Coating 불필요

● 일반 세포
① 이미 특정 조직의 세포로 분화하여 고유의 기능을 수행함
② 다른 종류의 세포로 분화 불가
③ 자신과 동일한 세포를 복제하는데 제한적임
→ 다양한 종류의 일반적인 세포가 생존하고 증식할 수 있도록 기본적인 영양분, 비타민, 아미노산 등을 제공하는데 중점

● Stem Cell Media
① 특정한 역할을 부여 받지 않은 미분화 상태의 세포
② 뼈, 근육 등 다양한 조직세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가짐
③ 미분화 상태에서 자가복제를 통해 자신과 동일한 줄기세포를 무한히 만들어 낼수 있음
→ 줄기 세포를 증식시키거나 특정세포로 분화시키기 위해 맞춤형 영양분, 성장인자를 첨가함. 필요에 따라 동물 유래성분이 첨가되지 않은 특정 spec이 요구됨

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① 로트 간 성분 차이 (Lot-to-lot Variation)

② 세포주별 반응 차이

③ 실험 재현성 확보

③ 비용 및 리스크 최소화

● 냉장, 상온제품의 경우 냉동보관이 가능한 경우도 있고 그렇지 않은 경우도 있습니다.

① PBS, Trypsin-EDTA, 완충액: 냉동 시 염 농도 차이로 결정화가 생길 수 있어 용기 파손 위험 있음. 권장하지 않음

② 세포배양 배지 (DMEM, RPMI 등): -20℃ 보관 가능. 다만 여러 번 동결·해동은 피해야 함.

     단, FBS가 첨가된 배지는 성분 침전이나 단백질 변성이 일어날 수 있으므로 냉장보관 권장

③ 항생제: -20℃ 보관 가능

PBS의 기본조성은 sodium phosphate와 NaCl이며 isotonic 환경과 pH 환경을 인체와 같이 만들어 주는 역할을 합니다.
여기에 calcium과 magnesium을 더한 것이 DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline)라 하는데,
웰진 제품 중에는 calcium이나 magnesium이 없는 제품도 있습니다.


PBS는 일반적인 세포 세척, 시약 희석, 분자생물학 실험용으로 광범위하게 사용되며,
D-PBS는 세포에 더 적합한 이온 균형을 제공하므로 세포배양용으로 최적화된 조성입니다.

▶ PBS 제품 링크
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한편, calcium이나 magnesium이 있는 D-PBS의 경우 부착 세포의 형태 유지에 유리하여 세포 간 결합이나 부착 유지에 도움을 주며,
calcium이나 magnesium이 없는 D-PBS의 경우 세포 분리(trypsinization) 전 세척 시 주로 사용합니다.

● Heat Inactivated FBS (열 불활성화 FBS)

① 보체(Complement) 단백질 불활성화 → 세포 용해 및 독성 반응 방지
② 열처리로 인해 침전물 발생 가능


● 일반 FBS (Non-Heat Inactivated)

① 보체, 단백질, 성장인자 손상 없음 → 세포 성장에 유리
② 특정 실험에서 세포 손상 위험 존재


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