Cell Freezing Medium – DMSO
Minimum Essential Medium Eagle
With 10% dimethyl sulfoxide (DMSO)
With 10% fetal bovine serum (FBS)
Catalog Number FM 001-01
Storage Temperature -5~-20°C
제품설명
세포
배양시 보통 일만개에 한 개의 비율로 돌연변이체가 생기며 장기간에 걸쳐 계대 배양을 계속하게 되면 본래의 세포 집단과는 전혀 다른 세포
집단으로 변할 수 있습니다.
이러한 유전적 변이를 최소화하고 노화와 형질전환을 방지하는 등
세포주를 안정하게 보존하고 또한 오염에 의한 소실을 방지하기 위해서 세포의 동결 보존은 반드시 필요합니다.
세포의 동결 보존시 세포에 내동성을 부여하기 위해서 dimethyl
sulfoxide
(DMSO) 또는 glycerol을 첨가하는데,
glycerol 보다 DMSO가 더 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 5~10%
농도로 배양배지에 첨가한 freezing
medium을 많이 사용하지만 세포에 따라 농도는 달라질 수 있습니다.
Freezing medium(FM 001-01또는
FM
001-02)에 포함된 DMSO는 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로 동결 조작은 신속하게 해야 합니다.
FM
001-01은 MEM (Minimum Essential Medium
Eagle)을 기본조성으로 하여 DMSO가 10% 되게, 또한 FBS가 10% 되게 각각 첨가되어있습니다.
동결 보존할 세포는 보존전에 오염 여부를 확인하여야 하고 대수
증식기(log
phase)에 있는 활성적인 세포를 이용하며 고밀도(5X106~1X107
cells/ml)로 저장합니다.
동결시 감온 속도는 세포에 따라 다르며 보통 -1°C/min
속도로 동결합니다.
Programmed cooler를
이용하거나 또는 솜을 채운 ice
box에 저장할 세포가 포함된 vial을 넣고 -70~-90°C의 deep-freezer에 정치한 후 액체 질소로 옮김으로써 동결 보존을 완료할 수
있습니다.
액체 질소는 증발이 잘 되므로 정기적으로 그 수위를 검사하고
다시 채우는 등의 관리가 필요합니다.
보관 및 안정성
Cell Freezing Medium은 차광하여 -5~-20°C에서 보관하여야 합니다.
Cell Freezing Medium의
변성은 (1) 침전물 또는 부유물, (2)
용액의 탁해짐, (3)
색의 변화, 그리고 (4) pH의 변화 등으로 나타날 수 있습니다.
추가로 첨가하는 첨가제의 성질에 의해 보관조건 및 배지의 유효
기간이 바뀔 수 있습니다. 유효기간은 제품 라벨에 표시 되어있습니다.
생물학적 특성
Cell Freezing Medium의 속성은 세포저장 후의 다시 해동하여 시험합니다. 성장 속도는 세 번의 계대 배양을 통하여 측정하고 표준품에서
배양한 것과 비교합니다.
시간에 따른 세포수의 변화를 측정하고 seeding
efficiency, doubling time, 그리고
최종 세포농도를 결정합니다.
시험을 하면서 현미경으로 세포의 형태 변화와 cytotoxicity의 현상이 나타나는지 관찰합니다.
세포의 동결 저장
부착세포의 경우
1. 배양
배지를 제거하고 Ca2+와 Mg2+가 없는 DPBS (LB 001-02) 또는 HBSS (LB 003-03, LB 003-04)로 세포 단층을 씻어 냅니다.
2. Trypsin 또는 Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 탈착시키고 80 xg에서 2~3분간 원심하여 Trypsin
또는 Trypsin-EDTA를 완전히 제거합니다.
3. 배양 배지로 세포 침전을 현탁하고 다시 80 xg에서 2~3분간 원심하여 잔존한 Trypsin
또는 Trypsin-EDTA를 제거합니다.
4. 세포침전에 Cell
Freezing Medium을
첨가한후 pipetting을 통하여 세포를 충분히 현탁합니다.
5. 세포 현탁액을 cryotube에 분주합니다.
6.
-1°C/min 속도로 동결한 후 액체 질소로 옮깁니다.
7. 액체 질소에 동결저장된 vial을 녹여서 세포 생존율 및 증식을 확인한 후 동결보존을 완료합니다.
부유세포의 경우
1. 80 xg에서
2~3분간 원심하여 배양상층액을 버리고 세포 침전을 cell
freezing medium에
현탁합니다.
2. 세포 현탁액을 cryotube에 분주합니다.
3.
-1°C/min 속도로 동결한 후 액체 질소로 옮깁니다.
4. 액체 질소에 동결저장된 vial을 녹여서 세포 생존율을 확인한 후 동결보존을 완료합니다.
*원심속도는 세포에 따라 달라질 수 있습니다.
동결 저장된
세포의 배양
부착 세포의 경우(37°C에서
배양하는 세포의 경우)
1. 37°C 수조에서 배지를 미리 항온합니다.
2. 동결 보존 세포를 포함한 vial을 액체 질소에서 꺼내는 즉시 37°C 항온 수조에서 재빨리 해동시킵니다.
3.
DMSO나 glycerol을 제거하고자 할 경우에는 80 xg에서 2~3분간 원심하여 상청액을 버리고 새로운 배지에 세포를 현탁합니다.
DMSO나 glycerol을 제거하지 않아도 될 경우에는 원심하지 않고 새로운 배지에
세포를 현탁합니다.
4. 배양 용기에서 배양합니다.
5. 다음날 새로운 배지로 교환합니다.
6. 현미경으로 세포를 관찰하며 2~3일마다 새로운 배지로 교체해주고 세포가 배양 용기를 꽉 채우게
되면 계대 배양합니다.
부유 세포의
경우 (37°C에서
배양하는 세포의 경우)
1. 37°C 수조에서 배지를 미리 항온합니다.
2. 동결 보존 세포를 포함한 vial을 액체 질소에서 꺼내는 즉시 37°C 항온 수조에서 재빨리 해동시킵니다.
3.
DMSO나 glycerol을 제거하고자 할 경우에는 80 xg에서 2~3분간 원심하여 상층액을 버리고 새로운 배지에 세포를 현탁합니다.
DMSO나 glycerol을 제거하지 않아도 될 경우에는 원심하지 않고 새로운 배지에
세포를 현탁합니다.
4. 배양 용기에서 배양합니다.
5. 다음날 새로운 배지로 교환합니다. 이때는 원심하여 배양액을 버리고 새로운 배지로 세포 침전을
현탁하여 배양용기에서 배양합니다.
6. 현미경으로 세포를 관찰하며 2~3일마다 새로운 배지로 교체해주고 세포의 개수를 측정하여 일정
수준 이상이 되면 계대 배양합니다.
*원심속도는 세포에 따라 달라질 수 있습니다.
Precautions
For In Vitro Use Only
