Exosome은 세포 간 신호 전달에 중요한 역할을 하는 나노 크기의 소포체(30~150 nm)입니다.

Mesenchymal Stem Cell로부터 Exosome을 효과적으로 분리·정제하기 위해 기본적으로 초고속 원심분리법 (Ultracentrifugation)을 사용하며,

필요에 따라 크기배제 크로마토그래피 (Size-Exclusion Chromatography)나 밀도구배 원심분리법 (Density Gradient Ultracentrifugation)과 같은 추가적인 정제 방법을 사용할 수 있습니다.

1.      시약

•      PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free, 멸균 처리)

•      FBS (Exosome-free, Ultracentrifugation 처리된 것 또는 상용 제품 사용)

•      MSC 배양배지

2.      장비

•      CO₂ 인큐베이터

•      초저온 냉동고 (-80°C)

•      Centrifuge (4°C 유지 가능)

•      Ultracentrifuge

•      0.22 µm 필터 (Sterile)

•      Nanosight (Nanoparticle tracking analysis, NTA) 또는 TEM (Transmission Electron Microscopy)

•      Western blot 또는 ELISA (Exosome 마커 확인용)

•      qNano (Exosome 크기 분석용, 옵션)

실험 방법

1.     MSC 배양 및 배지 준비

①     MSC를 FBS-free 또는 Exosome-free FBS를 포함한 배지에서 배양합니다.

②     세포가 80~90% confluency에 도달하면 fresh media로 교체하고, 48시간 동안 배양합니다.

③     배양 후 배지 상층액 50~200 ml을 수집하여 4°C에서 보관합니다.

2.     Exosome 분리 및 정제 (Ultracentrifugation 기반)

①     세포 파편 및 잔여 물질 제거

•       300 × g, 10 min, 4°C → 부유 세포 제거

•       2,000 × g, 20 min, 4°C → 세포 찌꺼기 제거

•       10,000 × g, 30 min, 4°C → Apoptotic body 제거

②     Exosome 농축 및 정제

•       100,000 × g, 70 min, 4°C → Exosome pellet 생성

•       PBS 10 ml로 재부유 후 100,000 × g, 70 min, 4°C

•       Pellet을 PBS 200~500 µl에 부유 → Exosome 정제 완료

•       0.22 µm 필터를 사용하여 상층액을 여과하여 남은 세포 잔해를 제거 (선택)

•       Exosome 샘플을 -80°C에서 보관하거나 즉시 분석

3.      원심분리 시 주의사항

•       초고속 원심분리 시 균형을 정확히 맞춰야 합니다.

-       밀리그램 수준까지 동일하게 조정 필요

•       Ultra-clear tubes 또는 Polycarbonate tubes 사용을 권장합니다.

-       일반 플라스틱 튜브는 초고속 원심분리에 견디지 못함

•       초고속 원심분리 후 Pellet이 거의 보이지 않을 수 있어 조심스럽게 PBS로 재부유합니다.

•       원심분리 직후 4°C에서 Exosome을 보관하거나 즉시 분석하는 것을 권장합니다.

4.     Exosome 특성 분석

①     단백질 분석 (Exosome Marker 확인)

•       Western blot: Exosome 마커 (TSG101, CD63, CD9, CD81) 발현 확인

•       ELISA: Exosome 표면 단백질 발현 분석

②     크기 및 농도 측정

•       Nanoparticle Tracking Analysis (NTA, NanoSight) → Exosome 크기 및 농도 측정

•       Dynamic Light Scattering (DLS) → 평균 입자 크기 분석

•       Transmission Electron Microscopy (TEM) → Exosome 모양 및 크기 확인

•       Exosome-free FBS를 사용하지 않으면 FBS 유래 Exosome이 오염될 수 있습니다.

•       0.22 µm 필터를 이용해 배양 배지를 사전 여과하면 큰 세포 잔해를 최소화할 수 있습니다.

•       원심분리 시 온도 조절(4°C) 필수입니다.

•       초고속 원심분리 대신 SEC, PEG-based precipitation 등의 대체 방법을 사용할 수 있습니다.

•       Exosome 샘플 보관 시 -80°C에서 보관하는 것이 안정성을 유지하는 데 중요합니다.

성공적인 실험을 기원합니다!