PCR은 DNA의 원하는 부분을 프라이머를 사용하여 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술입니다.
이 기술은 사람의 게놈과 같이 매우 복잡하며, 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하
는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있습니다.
또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정
도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, PCR과 여기서 파생한
여러 가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서
지극히 중요한 역할을 담당하고 있습니다.
하기에서는 Taq polymerase를 사용한 일반적인 PCR 방법에 대해 알아보겠습니다.
1. 준비물
• PCR 기기: 온도를 순환시키면서 각 단계의 반응 조건을 유지하기 위한 장치
• 템플릿 DNA: 증폭하고자 하는 특정 DNA 서열(target)이 포함된 샘플
• 프라이머: 템플릿 DNA의 양쪽 끝을 특이적으로 인식하고 결합하는 짧은 DNA 서열
• dNTPs(디옥시뉴클레오타이드): 새로운 DNA 가닥을 합성하기 위한 빌딩 블록(A, T, C, G)
• DNA 폴리머라제(예: Taq polymerase): 열 안정성이 높은 효소로, DNA를 합성하는 역할
• 버퍼: 효소의 최적 활성화를 위해 필요한 이온과 pH를 제공
• MgCl₂: 폴리머라제의 효율적인 작용에 필수적인 마그네슘 이온 제공
2. PCR 혼합물(mixture) 구성
• 템플릿 DNA: 보통 1~100 ng의 DNA
• 프라이머: 각 0.1~0.5 μM (forward와 reverse 프라이머)
• dNTPs: 200 μM (각 뉴클레오타이드)
• Taq DNA polymerase: 1~2.5 유닛
• 10x PCR 버퍼: 최종 반응 혼합물에서 1x 농도로 맞추어 사용
• MgCl₂: 1.5~2.5 mM (종종 PCR 버퍼에 이미 포함되어 있음)
3. PCR 반응 조건
일반적인 PCR 반응은 3단계의 사이클을 25-35회 반복하며, 다음과 같이 반응을 설정합니다.
1. 초기 변성(Initial denaturation)
2.
온도: 94-95°C
• 시간: 2-5분
• 목적: 이 단계에서는 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 변성시키기 위해 고온에서 가
열합니다.
2. 사이클 반응: 이 사이클은 보통 25-35회 반복되며, 각 단계는 다음과 같습니다.
가) 변성(Denaturation)
• 온도: 94-95°C
• 시간: 15-30초
• 목적: 템플릿 DNA의 이중 가닥을 분리하여 단일 가닥으로 만듭니다.
나) 결합(Annealing)
•온도: 프라이머의 Tm (녹는점) 온도에 따라 설정 (보통 50-65°C)
•시간: 15-60초
•목적: 프라이머가 템플릿 DNA의 특정 위치에 결합하도록 온도를 낮춥니다.
다) 신장(Extension)
• 온도: 72°C (Taq 폴리머라아제의 최적 활성 온도)
• 시간: 1분/kb의 길이
• 목적: 폴리머라아제가 프라이머부터 시작하여 새로운 DNA 가닥을 합성합니다.
3. 최종 신장(Final Extension)
• 온도: 72°C
• 시간: 5-10분
• 목적: 모든 증폭되지 않은 DNA 가닥이 완전히 합성될 수 있도록 합니다.
4. 보관(Hold)
• 온도: 4°C
• 시간: 무한대
• 목적: 반응 종료 후 PCR 산물을 안정적으로 보관하기 위함입니다.
4. PCR 반응 후
PCR 이 완료된 후에는 증폭된 DNA 산물을 전기영동을 통해 확인합니다. 일반적으로 아가로스 겔
전기영동을 사용하여 증폭된 DNA 밴드를 확인하고, 원하는 크기의 DNA 밴드가 있는지
평가합니다.
■ 팁!!
• 프라이머 디자인: 특정성 높고 효율적인 증폭을 위해 프라이머의 길이는 18-25 bp, Tm
온도는 50-65°C가 적당합니다.
• 사이클 수: 25-35 사이클이 일반적이나, 사이클 수가 너무 많으면 비특이적 증폭이 증가할
수 있으므로 적절한 범위 내에서 설정합니다.
• MgCl₂ 농도 최적화: 너무 낮으면 DNA 합성이 잘 안되고, 너무 높으면 비특이적 결합이
증가할 수 있으므로 최적 농도를 설정하는 것이 중요합니다.
이 기본적인 PCR 프로토콜을 통해 원하는 DNA 시퀀스를 증폭할 수 있습니다. PCR 조건은
템플릿과 프라이머에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.