1. 실험목적

이 실험의 목적은 DNS(Dinitrosalicylic acid) 방법을 이용하여 시료 내 포함된 환원당, 특히 glucose의 함량을 정량적으로 측정하는 것이다. DNS assay는 환원당이 3,5-dinitrosalicylic acid를 환원시켜 적갈색의 화합물을 생성하는 원리를 이용한 비효소적 비색 정량법이다. 생성된 적갈색 화합물의 흡광도를 540 nm에서 측정함으로써 환원당의 농도를 추정할 수 있다.

2. 시약 및 장비

2.1 시약

- DNS 시약: 3,5-dinitrosalicylic acid 1.0 g, 2 M NaOH 20 mL, sodium potassium tartrate 30 g을 증류수로 100 mL로 제조
- Glucose 표준용액: 1 mg/mL stock을 준비하여 0~1.0 mg/mL 범위로 희석
- Distilled water (DW): 희석 및 blank용
- 40% sodium potassium tartrate 용액: 반응 안정화 및 희석용
- 분석 시료: 배양액, 발효액, 식품 추출물 등

2.2 장비

- 시험관 또는 glass test tube
- 마이크로피펫 및 팁
- 끓는 물 중탕기 (boiling water bath)
- 아이스 배스 (ice bath)
- 분광광도계 (Spectrophotometer, 540 nm 필터 사용)
- 흡광도 측정용 cuvette 또는 microplate reader (옵션)

3. 실험 절차

1. Glucose 표준곡선을 작성하기 위해 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL의 농도로 표준용액을 준비하고 각 농도별로 1.0 mL씩 시험관에 분주한다.
2. 분석 대상 시료도 1.0 mL씩 준비하되, 고농도일 경우 10~100배 희석하여 준비한다.
3. 각 시험관에 DNS 시약 1.0 mL를 첨가하고, 끓는 물 중탕에서 5~10분간 가열하여 발색시킨다.
4. 반응을 종료하기 위해 가열 후 즉시 시험관을 얼음물에 넣어 냉각한다.
5. 냉각 후 증류수 또는 40% sodium potassium tartrate 용액 7.0 mL를 추가하여 반응액을 총 8.0 mL로 희석한다.
6. 각 반응액의 흡광도를 540 nm에서 측정한다. Blank는 증류수 1.0 mL + DNS 시약 1.0 mL을 동일하게 처리한 후 측정한다.

4. 계산 방법

표준용액의 농도와 해당 흡광도를 이용하여 표준곡선을 작성한다. X축은 Glucose 농도 (mg/mL), Y축은 흡광도이며, 선형 회귀분석을 통해 직선 방정식(y = ax + b)을 도출한다.
시료의 흡광도를 이 회귀식에 대입하여 Glucose 농도를 계산하며, 희석된 경우에는 희석배수를 곱하여 원래 농도를 산출한다.

계산식:

Glucose 농도 (mg/mL) = (A_sample – A_blank) ÷ slope × 희석배수

5. 주의사항

- DNS 시약은 고온에서 가열 시 증기와 냄새가 발생할 수 있으므로 반드시 흄 후드 내에서 가열한다.
- 모든 반응은 동일한 시간과 온도 조건에서 수행되어야 하며, 발색의 일관성을 위해 시료 간 반응시간 차이를 최소화해야 한다.
- DNS 시약은 빛과 산소에 민감하므로 갈색병에 밀봉하여 냉장보관하며, 1주일 이내에 사용한다.
- 이 방법은 환원당 전체를 측정하므로 glucose 외에도 fructose, maltose 등도 측정될 수 있으므로 혼합 시료의 경우 주의가 필요하다.
- 정확한 분석을 위해 각 시료는 최소 3회 반복 측정(triplicate)하는 것이 권장된다.

6. 결론

DNS 환원법은 효소를 사용하지 않고도 Glucose와 기타 환원당을 정량할 수 있는 간편하고 경제적인 방법이다. 특정 당류에 대한 선택성이 없다는 점이 단점일 수 있으나, 식품, 발효, 생화학 분야 등에서 널리 활용된다. Glucose를 정확하게 분리하여 측정해야 할 경우에는 GOD-POD 효소법 등의 선택적 방법이 보다 적합하다.