DNA Mini-Agarose Gel Electrophoresis

1. 50X TAE Buffer*1 또는 5X TBE Buffer*2의 준비.

2. Running buffer로 0.5X TAE (TBE) 또는 1X TAE (TBE) 의 준비.
A. 0.5X TAE: 10 ml의 50X TAE buffer를 990 ml의 물에 첨가하고 잘 섞는다.
B. 1.0X TAE: 20 ml의 50X TAE buffer를 980 ml의 물에 첨가하고 잘 섞는다.
C. 0.5X TBE: 100 ml의 5X TBE buffer를 900 ml의 물에 첨가하고 잘 섞는다.
D. 1.0X TBE: 200 ml의 5X TBE buffer를 800 ml의 물에 첨가하고 잘 섞는다.
* 일반적으로 mini-agarose gel을 사용하는 전기영동에는 0.5X TAE buffer를 running buffer로 사용한다.
Gel의 %가 높을 수록 (많은 전류량을 필요로 할 때) 고농도의 running buffer를 사용한다.

3. 1.0%의 mini-agarose gel의 준비
A. 250 ml flask에 120 ml의 희석한 running buffer를 넣고 1.2 g의 agarose를 첨가한다.
B. Microwave (전자렌지)로 30 초씩 3회 정도 끓여 agarose를 완전히 녹인다.
C. 65℃ 까지 식힌 후 6 μl의 10 mg/ml EtBr (ethidium bromide) 용액을 첨가하고 잘 섞는다.

- 최종 농도는 0.5 μg/ml EtBr이 된다.
- EtBr은 매우 강한 발암 물질이고 돌연변이 유도물질 이므로 반드시 피부 보호용 비닐 장갑을 착용하여야 한다.
사용한 후에는 별도의 폐수통에 수거하여 활성을 완전히 없앤 후 폐기하여야 한다.
D. 준비된 gel 용액을 gel plate에 붓고 이 때 comb의 표면에 기포가 생기지 않도록 한다.

4. 상온에서 약 30분 정도 gel을 굳힌 후 gel로부터 comb을 조심스럽게 분리한다.

5. Gel을 전기영동 장치의 chamber에 놓고 희석한 running buffer를 부어 수면으로부터 gel 이 1 mm 정도 잠기게 한다.

6. DNA sample의 준비 A. DNA sample의 1/5 volume 되는 양의 6X loading dye를 DNA sample에 첨가한다.
(ex. 5 μl of DNA sample + 1 μl of 6X loading dye)
- EtBr 염색으로 확인될 수 있는 최소의 DNA 양은 약 2 ng (0.5 cm wide band) 정도이다.
또한 500ng 이상의 DNA는 gel 상에서 선명한 band로 나타나지 않고 끌린 자국이 남게 된다.
- 6X loading dye (Xylene cyanole FF를 제외한 조성도 널리 사용된다.)

7. DNA sample을 well에 조심스럽게 loading하고 전기영동을 시작한다.
- DNA sample이 있는 tip 끝이 well 바닥에 닿아 well이 손상되지 않도록 조심하여야 한다.
- 전기영동 장치의 전극은 음극이 gel의 well 쪽으로 오게 설치하여야 한다.
DNA는 running buffer의 조건에서 음전하를 띄기 때문에 양극 쪽으로 이동하게 된다.

8. Bromophenol blue가 gel의 중간 정도 까지 이동했을 때 전기 스위치를 끄고 gel을 UV illuminator 위에 놓고
DNA를 관찰한다. - UV 상에서 DNA를 관찰할 때에는 보호용 안경 등을 착용하여야 하며, 직접 눈으로 관찰하지 않는다.