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세포의 계대배양

아래에 언급된 배양 방법은 가장 일반적인 배양법이며 세포의 종류에 따라 그 방법에 차이가 있을 수 있다.

부착 세포의 계대 배양
1. 배양 배지를 제거한다.
2. Ca2+와 Mg2+가 포함되지 않은 D-PBS (JBI, Cat. No. LB 001-02) 또는 HBSS (JBI, Cat. No. LB 003-03 또는 LB 003-04)로 세포층을 씻어 낸다.
3. Cell dissociation reagent (i.e. trypsin또는 trypsin-EDTA, EDTA soluton)를 처리한다.
4. Cell dissociation reagent를 제거하고, 배양 용기에서 세포가 탈착 될때까지 상온 또는 37°C에서 2 - 10분간 정치한다.
5. 현미경으로 세포의 탈착을 확인한 후 새로운 배지로 세포를 현탁한다. 이때 새로운 배지에 혈청이 포함되어 있다면 위의 trypsin을 완전히 제거할 필요가 없지만 serum-free media나 protein-free media를 사용할 경우에는 trypsin inhibitor를 사용하거나balance salt solution으로 여러 번 세척하여 trypsin을 제거한 후 새로운 배지로 현탁한다.
6. 세포수를 측정한다.
7. 적절한 세포 밀도가 형성되도록 세포 현탁액을 취하여 새로운 배지로 희석한 후 배양한다.
8. 더 이상 배양할 필요가 없을 때 동결 보존한다. 세포의 동결 보존시에는 세포에 내동성을 주기 위해서 DMSO나    glycerol을 5 - 10% 첨가하는데 glycerol 보다 DMSO가 더 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 일반적으로 동결 배지에    포함된 DMSO는 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로 조작을 신속하게 해야한다.
세포는 -1°C/min 속도로 동결하며 최종적으로는 액체 질소에 저장한다.

 

부유 세포의 계대 배양
부유 세포의 계대 배양법은 부착 세포의 계대 배양법보다는 간단하다.

1. 부유 배양액을 원심관에 옮겨서 80 xg에서 2 - 3분간 원심한다.
2. 상청액은 버리고 새로운 배지로 세포 침전물을 현탁한다.
3. 세포수를 측정한다.
4. 적절한 세포 밀도가 형성되도록 세포 현탁액을 취하여 새로운 배지로 희석한 후 배양한다.
5. 더 이상 배양할 필요가 없을 때 동결 보존한다. 세포의 동결 보존시에는 세포에 내동성을 주기 위해서 DMSO나 glycerol을 5~10% 첨가하는데 glycerol 보다 DMSO가 더 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 일반적으로 동결 배지에 포함된 DMSO는 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로 조작을 신속하게 해야한다. 세포는 -1°C/min 속도로 동결하며 최종적으로는 액체 질소에 저장한다.