Serum-free hybridoma media 또는 protein-free hybridoma media로의 적응 방법
T-flask배양:
1.혈청이 포함된 배지에 배양된 대수증식기(log phase)의 hybridoma 세포를 1,500 rpm에서 5분간 원심한다.
2.상층을 제거하고 세포 침전물을 37°C에서 항온된 Serum-Free Hybridoma Media 또는 Protein-Free Hybridoma Media로 pipet을 이용하여 잘 현탁한다.
3.초기 세포농도를 2 ~ 5 x 105 cells/ml 로 하여 새로운 T-flask로 옮긴다.
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* 최적 배양 배지 부피 |
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T-25 flask |
: 5 – 10 ml |
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T-75 flask |
: 15 – 25 ml |
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T-175 flask |
: 35 – 50 ml |
* 혈청배지에서 배양된 cell을 serum-free 또는 Protein-Free Media에 처음으로 배양할 때는 초기세포농도를 가능한 높게 (4 x 105 cells/ml 이상) 시작하는 것이 좋다.
4.CO2 배양기 (5% CO2, 95% air)에서 정치 배양 한다.
* CO2 배양기를 사용하지 않고 일반 BOD 배양기를 사용하기 위해서는 1 M HEPES 용액(WelGENE, Cat. NO. BB 001-01)을 첨가하여 15 - 25 mM 되게 한 후 배양한다.
5.세포 농도가5 x 106 cells/ml (1:5 - 1:10 계대 배양 후 2~4일) 전후에 도달되면 계대배양 한다.
6.계대 배양할때는 배양액 20%에 새로운 배지 80%를 넣어 1:5로 계대배양하며, 3 - 4회 계대 배양할 때마다 전체 배지를 새로운 배지로 바꿔주는 것이 바람직하다.
* 세포 생존도 (cell viability)가 70% 이하일 경우에는 저속원심 (800 rpm, 5 min)하여 상층을 제거하고 새로운 배지로 잘 현탁한 후 배양한다.
Spinner flask 배양:
1.혈청이 포함된 배지로 T-flask 에서 배양된 대수증식기(log phase)의 hybridoma 세포를 1,500 rpm에서 5 분간 원심한다.
2.상층을 제거하고 37°C에서 항온된 Serum-Free Hybridoma Media 또는 Protein-Free Hybridoma Media로 세포 침전물을 pipet을 이용하여 잘 현탁시킨다.
3.초기 세포농도를 4 - 6 x 105 cells/ml 로 하여 spinner flask로 옮겨 배양한다.
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* 최적 배양배지 부피 |
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250 ml spinner flask |
: 80 – 110 ml |
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500 ml spinner flask |
: 180 – 250 ml |
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1 L spinner flask |
: 350 – 500 ml |
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3 L spinner flask |
: 600 – 1200 ml |
4.혈청 배지에서 배양된 세포를 Serum-Free Hybridoma Media 또는 Protein-Free Hybridoma Media에 처음으로 배양할 때는 초기 세포 농도를 가능한 높게 (4 x 105 cells/ml 이상) 시작한 후 3회 정도 같은 초기 세포 농도로 계대 배양하여 세포 생존도가 높고 (90% 이상) 세포성장이 비슷하면 (최대 세포 농도가5 - 3 x 106 cells/ml) 초기 세포 농도를 2 - 4 x 105 cells/ml 사이로 하여 배양한다.
5.CO2 배양기 (5% CO2, 95% air)에서 40 rpm 으로 교반하면서 배양한다.
* CO2 배양기를 사용하지 않고 일반 BOD 배양기를 사용하기 위해서는 1 M HEPES 용액(BB 001-01)을 첨가하여 15 - 25 mM 되게 한 후 배양한다.
6.세포 농도가5 x 106 cells/ml (1:5 - 1:10 계대 배양 후 약 2 - 4일) 전후에 도달되면 계대 배양 한다.
7.계대 배양할때는 배양액 20%에 새로운 배지 80%를 넣어 1:5로 계대 배양하며, 3 - 4회 계대 배양 할 때마다 전체 배지를 새로운 배지로 바꿔주는 것이 좋다.
* 세포 생존도(cell viability)가 70% 이하일 경우에는 저속원심 (800 rpm, 5 min)하여 상층을 제거하고 fresh media로 잘 현탁한 후 배양한다.
* Spinner flask를 이용하여 세포배양을 할 때에는 원활한 기체 교환을 위해서 양쪽 뚜껑을 1/4정도 열어서 배양한다.
* 배양 중간에 pH를 측정하여 pH 가 6.9 - 7.0 이하일때에는 0.5 N NaOH (LS 012-01) 또는 7.5% NaHCO3 (BB 002-01)를 0.5 – 1 ml/100 ml 배지에 첨가하여 조정한다.
* Serum-Free Media 또는 Protein-Free Media를 이용하여 hybridoma 세포를 배양하여 항체를 생산할 때에는 세포 생존도가 떨어져도 항체 생산은 지속되므로 세포 생존도가 30 - 40% 일때까지 배양하여도 된다.
항체 생산을 증가시키기 위해서는 필요하다면 Serum-Free Hybridoma Media, Protein-Free Hybridoma Media에 다음 첨가물을 추가로 첨가한다.
