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Mini-Prep of Plasmid DNA (Alkaline Lysis Method)

균주의 배양
* Selection agent로 ampicillin을 사용하고 LB medium을 사용할 경우.


1. 얻고자 하는 plasmid DNA로 형질전환된 E. coli 균주를 LB (MM 002-01)
+ ampicillin (100 μg/ml) agar plate에 streaking한다.


2. 37°C 배양기에서 overnight 배양한다.
이 성분들은 혈청 농도가 낮아질 때 특히 필요한 성분들이며, 동물 세포의 클로닝을 도와주기도 한다.


3. Overnight 배양한 E. coli 균주의 colony 한 개를 취해 2 ml의 LB+ampicillin (100 μg/ml) broth에 접종한다.

4. 37°C에서 overnight 진탕 배양한다 (200 rpm).


Plasmid의 분리
1. Overnight 배양한 배양액을 microcentrifuge tube로 옮기고 원심분리(10,000 rpm, 30 초, 상온)한다.

2. 상등액을 완전히 제거한다.

3. 100 ml의 ice-cold GTE buffer (ML 021-01 with lysozyme)*1 로 세포 침전물을 완전히 현탁시킨다.

4. 정기적으로 섞어주면서 상온에서 30분 간 반응시킨다.

5. 200 ml의 새로 준비한 ice-cold NaOH/SDS solution (ML 021-02)*2을 첨가하고 tube를 5회 정도 천천히 뒤집으면서 섞어준다.

6. 0°C (on ice)에서 5 분 간 방치한다.

7. 150 ml의 ice-cold Potassium Acetate solution (pH 5.5, ML 021-03)*3을 첨가하고 tube를 5회 정도 천천히 뒤집으면서 섞어준다.

8. 0°C (on ice)에서 5 분 간 방치한다.

9. 원심분리(12,000 rpm, 5 분, 4°C)하여 상등액을 새로운 tube에 옮긴다.
- 침전물이나 부유물이 포함되지 않게 조심한다.

10. 상등액에 동량의 phenol/chloroform (1:1, v/v) 을 첨가하고 30 초 간 vortexing한다.
- 10 kb 이상의 plasmid를 분리하는 경우에는 격렬한 vortexing은 피하는 게 바람직하다.

11. 원심분리(12000 rpm, 5 분, 4°C)하여 상등액을 새로운 tube에 옮긴다.
- 층이 깨어지지 않도록 조심한다.

12. 상등액에 동량의 chloroform을 첨가하고 30 초 간 vortexing한다.
- 10 kb 이상의 plasmid를 분리하는 경우에는 격렬한 vortexing은 피하는 게 바람직하다.

13. 원심분리(12000 rpm, 5 분, 4°C)하여 상등액을 새로운 tube에 옮긴다.
- 층이 깨어지지 않도록 조심한다.

14. 상등액에 2배 부피의 100% ethanol을 첨가하고 30 초 간 vortexing한다.
- 10 kb 이상의 plasmid를 분리하는 경우에는 격렬한 vortexing은 피하는 게 바람직하다.

15. -20℃에 2 시간 이상 방치한다.

16. 원심분리(12,000 rpm, 15 분, 4°C)하여 상등액을 버리고, 1 ml의 70% ethanol을 첨가하고 손가락으로 tapping하여 DNA 침전물을 tube 벽면에서 떼어낸다.

17. 원심분리(12,000 rpm, 5 분, 4℃)하여 상등액을 버리고 DNA 침전물을 3 분 간 진공건조하여 ethaonl을 완전히 제거한다.

18. 50 ml의 TE buffer (pH 8.0, ML 014-80 with RNase A)*4로 DNA 침전물을 현탁시킨다.

19. 상온에서 3 시간 이상(또는 37℃에서 1 시간) 반응시킨다.

20. 0.5 - 5 μl 정도로 전기영동하여 plasmid DNA를 확인한다.


Alkaline lysis method에 필요한 buffer와 용액

  1. GTE buffer (ML 021-01) + Lysozyme (20 mg/ml), 100 ml
     A. 97 ml의 멸균된 물에 0.3 g의 Tris, 0.9 g의 glucose, 그리고 2 ml의 0.5 M EDTA (pH 8.0)를 첨가하여 녹인다.
     B. 4°C에 보관한다.
     C. Lysozyme은 사용하기 직전에 사용할 양의 buffer를 취해 최종 농도 20 mg/ml이 되도록 첨가하여 사용한다.
 2. NaOH/SDS solution (ML 021-02), 1 ml
    A. 0.7 ml의 멸균된 물에 0.2 ml의 1 N NaOH 용액과 0.1 ml의 10% SDS 용액을 첨가하여 잘 섞어준다.
    B. 이 용액은 사용하기 직전에 준비하는 것이 바람직하다.
  3. Potassium Acetate solution (pH 5.5, ML 021-03), 100 ml
    A. 28.5 ml의 멸균된 물에 60.0 ml의 5 M potassium acetate 용액과 11.5 ml의 acetic acid (glacial)을
        첨가하여 잘 섞어준다.
    B. 이 용액은 최종적으로 3 M의 potassium과 5 M의 acetate를 갖는다.
    C. 상온에 보관한다.
 *4. TE buffer (pH 8.0, ML 014-80) + RNase A (20 mg/ml), 1 ml
    A. 0.98 ml의 멸균된 TE buffer (10 mM Tris base, 1 mM EDTA, pH 8.0, ML 014-80)에 20 μl의 1 mg/ml RNase
        A 용액을 첨가하여 잘 섞어준다.
    B. 이 용액은 사용하기 직전에 준비한다.